目前，吉非替尼和厄洛替尼等小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI）已被證明是治療晚期非小細胞肺癌（NSCLC）的有效靶向藥物，并只對表皮生長因子受體（EGFR）基因敏感突變類型的肺癌患者才顯示很好療效，肺癌患者在應用EGFR-TKI靶向治療前進行EGFR基因突變檢測具有重要臨床意義，而檢測結果的準確性也將直接影響患者靶向治療選擇和療效。本文就肺癌EGFR基因突變的分子病理學檢測中主要的質量控制和質量保證要點進行介紹。
 

    1、檢測實驗室及人員要求

    常規(guī)EGFR突變檢測方法基于基因擴增技術之上，其檢測應嚴格在基因擴增實驗室進行，實驗室包括試劑貯存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)和產物分析區(qū)等4個區(qū)。因肺癌EGFR檢測的標本多為石蠟包埋的組織蠟塊，實驗室應設置***的標本制備預處理區(qū)（切片區(qū)），嚴防標本在制片過程中被污染。各工作分區(qū)應標識清晰，儀器設備應滿足檢測要求，各工作區(qū)專用的儀器設備、辦公用品、工作服、實驗耗材和清潔用具等不可混用。檢測過程中嚴格質量控制，實驗完畢后做好清潔消毒工作。

    分子病理學聚合酶鏈式反應（PCR）實驗室工作人員應參加我國衛(wèi)生和計劃生育委員會指定的機構舉辦的技術培訓后取得合格證，并定期進行培訓。

    2、EGFR突變檢測的標本要求

    需要進行EGFR-TKI靶向治療的患者應進行EGFR基因突變篩選；臨床標準（女性，無吸煙史等）不能決定是否進行檢測；有研究表明，免疫組織化學染色（IHC）檢出總EGFR蛋白表達也不推薦TKI治療篩選。

    EGFR突變檢測，對肺癌部分切除標本建議用于腺癌和含腺癌成分的混合型肺癌，不考慮組織學分級；對肺癌全切標本，不建議用于無任何腺癌成分的肺癌，例如純鱗癌、純小細胞癌或IHC未顯示腺癌分化的大細胞癌；對小標本（活檢、細胞學標本），如果不能完全除外腺癌，可檢測組織學表現為鱗癌或小細胞癌的標本檢測，但應結合臨床標準（年輕患者、無吸煙史）協(xié)助篩選；對初治患者，檢測原發(fā)灶或轉移灶；對于多發(fā)性原發(fā)肺腺癌，可分別檢測，但不必對同一腫瘤多個區(qū)域檢測。

    在確定EGFR-TKI治療的進展期（Ⅳ期）肺癌患者，或低期別患者發(fā)生復發(fā)或進展（原先未進行檢測）時，應行EGFR突變檢測。由于肺癌復發(fā)轉移率高，對Ⅰ~Ⅲ期肺癌，在診斷時鼓勵患者進行檢測，以便出現復發(fā)時及時治療，但應視具體情況決定。

    3、EGFR突變檢測流程

    標本處理手術或活檢組織標本應在離體30分鐘內用10%中性福爾馬林固定，避免用酸性、重金屬固定液或脫鈣液等處理；活檢小標本固定6~24小時，手術切除大標本固定8~48小時；細胞學標本可用于EGFR突變檢測，細胞石蠟包埋塊優(yōu)于細胞涂片。

    標本評估及DNA提取對檢測標本進行病理形態(tài)學評估是EGFR檢測最重要的質量控制之一，病理醫(yī)生首先應評估整個樣本中腫瘤細胞含量（腫瘤細胞百分比），確定標本是否滿足檢測要求（所采用檢測方法的敏感性），必要時進行微切割富集腫瘤，EGFR突變檢測標本使用的切片機刀架座須清潔并消毒，不同標本切片時要更換刀片；制備3~10張厚8μm組織切片，對照HE染色結果刮取腫瘤細胞豐富區(qū)域，避開非腫瘤區(qū)和壞死區(qū)等；采用標準試劑盒提取基因組DNA，并測定DNA濃度。

    EGFR突變檢測EGFR突變檢測方法有很多種，應結合檢測標本特點來判斷是否進行檢測。最傳統(tǒng)的直接測序法（Sanger測序）可得到序列的直接信息，對未知突變的檢出具有優(yōu)勢，是直接有效地檢測基因突變狀態(tài)的方法，但敏感性較低，實驗操作時間長、步驟復雜、易污染。

    以實時定量PCR（RT-PCR）為平臺的突變檢測技術，均須根據已知的突變類型設計引物和探針，因此無法檢測出所有可能的突變，但敏感性較直接測序法高，操作簡單，不必對PCR產物進行操作，很大程度避免了擴增產物的污染。

    實驗室應采用能在至少含50%腫瘤細胞的標本中檢測到突變的方法。推薦采用更敏感的方法，至少能在含10%腫瘤細胞的標本中檢測到突變，但不可一味追求高敏感性，而忽視對特異性和準確性的考量。

    另外，不同實驗條件、不同樣本中檢測的最適方法也可能不同，應根據實際情況選擇適合的EGFR基因突變檢測方法，通過預實驗驗證所采用方法的準確性和敏感性，無論采用何種檢測方法，臨床EGFR基因突變檢測應能檢測所有突變頻率在1%以上的突變類型。

    EGFR突變檢測結果分析與報告EGFR突變檢測根據各自檢測方法的判讀標準分析檢測結果。測序法檢測EGFR基因突變，成功的峰形圖的峰形規(guī)則，如圖1，RT-PCR法檢測EGFR基因突變結果如圖2所示；如果檢測結果可疑（圖3，4），應重復進行檢測或采用其他的檢測方法驗證。

    EGFR突變檢測報告須包括結果和說明，報告內容應讓腫瘤醫(yī)生和其他病理醫(yī)生易于理解，檢測實驗室收到標本后2周（10個工作日）內簽發(fā)報告，平均檢測周期＞2周的實驗室應有措施（自身或第3方實驗室）來保證緊急病例能更快得到檢測結果。

    4、EGFR突變檢測的其他質量控制與質量保證

    分子檢測實驗室人員應嚴格按照已經驗證的標準化操作流程進行EGFR檢測，EGFR突變檢測驗證應與其他分子診斷相同，每次實驗設置陰性和陽性質控，定期總結檢測結果，及時發(fā)現并解決問題。

    實驗室每月采用不同的檢測平臺驗證一定數量的EGFR基因突變檢測結果，每年應至少參加兩次單項能力驗證（室間質控）。

    驗證機構有我國衛(wèi)生計生委病理質控中心（PQCC），國際機構如美國病理學家學會（CAP），歐洲分子基因診斷質量聯(lián)盟（EMQN）等。

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