染色體非整倍體異常是指細(xì)胞中個(gè)別染色體的增多或減少形成的染色體數(shù)目異常。產(chǎn)前診斷中最常見的胎兒非整倍體異常有21-三體、13-三體、18-三體以及性染色體綜合征等。染色體整倍體改變多導(dǎo)致流產(chǎn)，而非整倍體改變可以出生能存活的出生缺陷兒。因此，檢測(cè)胎兒非整倍體異常是許多孕婦接受產(chǎn)前診斷的主要原因。傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷措施是采用侵入性方法獲取胎兒物質(zhì)，如絨毛取樣、羊水穿刺和胎兒臍靜脈穿刺等，這些操作會(huì)給胎兒帶來一定的風(fēng)險(xiǎn)。

    1969年Walknowska等在懷男胎的孕婦血液循環(huán)中發(fā)現(xiàn)了46，XY的中期分裂相，因此提出母血中可能存在著胎兒細(xì)胞。這一觀點(diǎn)引起了人們對(duì)無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷的興趣。研究者希望從母血中富集胎兒細(xì)胞獲得胎兒染色體信息，由于母體循環(huán)中的胎兒細(xì)胞數(shù)量稀少，細(xì)胞的富集過程既復(fù)雜且價(jià)格昂貴，所以至今尚不能應(yīng)用于臨床。1997年，Lo等在孕婦的血漿和血清中檢出了游離的胎兒DNA。2000年P(guān)oon等在孕有男胎的孕婦血漿中首次發(fā)現(xiàn)Y染色體特異的RNA，這些發(fā)現(xiàn)為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷胎兒染色體異常開創(chuàng)了一個(gè)新的研究領(lǐng)域。本文就無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷胎兒染色體非整倍體的研究及其進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

    一、利用孕婦外周血中胎兒細(xì)胞診斷胎兒非整倍體異常

    利用孕婦外周血中胎兒細(xì)胞產(chǎn)前診斷胎兒非整倍體異常，其主要優(yōu)勢(shì)在于分離提取的胎兒細(xì)胞所提供的是純凈的胎兒核酸，含有完整的胎兒基因組DNA，因此能夠進(jìn)行完整的胎兒染色體核型分析。這是孕婦外周血中胎兒游離DNA或游離RNA所無法比擬的。已發(fā)現(xiàn)的孕婦外周血中胎兒細(xì)胞主要有滋養(yǎng)細(xì)胞、胎兒有核紅細(xì)胞（nucleated red blood cell，NRBC）、淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞等。近年還發(fā)現(xiàn)一種類似于干細(xì)胞的胎兒細(xì)胞存在于孕婦外周血中。目前為止研究較多的是NRBC。相對(duì)其他細(xì)胞來說，NRBC是單核細(xì)胞，壽命短且穩(wěn)定，增殖能力有限，不能滯留到下次妊娠。另外，NRBC有明顯形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和特殊的細(xì)胞表面標(biāo)志物，易于識(shí)別。因此 NRBC被認(rèn)為是理想的無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷的靶細(xì)胞而受到較多的關(guān)注。

    1991年，Price首次應(yīng)用18號(hào)染色體特異性探針對(duì)母血中胎兒細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，診斷出1例18-三體胎兒。Bischoff等采集40例孕婦外周血，以抗CD71和CD45單抗標(biāo)記NRBC，用流式細(xì)胞儀分離胎兒細(xì)胞，以 X、Y、13、18和21號(hào)染色體特異性探針進(jìn)行熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH），準(zhǔn)確測(cè)定出2例21-三體的胎兒。另外也有研究者報(bào)道通過FISH方法檢測(cè)出21-三體綜合征、13-三體綜合征和18-三體綜合征等染色體非整倍體病例，并且有較低的假陽性率。

    為了評(píng)價(jià)利用孕婦外周血中胎兒細(xì)胞進(jìn)行非侵入性產(chǎn)前診斷或篩查胎兒染色體異常是否可以應(yīng)用于臨床，由美國**衛(wèi)生研究院支持，美國兒童健康和發(fā)展研究院（nationalinstitute of child health and development，NICHD）發(fā)起了一個(gè)大規(guī)模的臨床研究，由Bianchi等共收集了6個(gè)中心2 744例樣本，采用磁性激活細(xì)胞分選法（magnetic activated cell sorting，MACS）或熒光激活細(xì)胞分離技術(shù)（fluorescence activated cellsorting，F(xiàn)ACS）富集胎兒細(xì)胞，并用FISH方法檢測(cè)獲得的單胎男性胎兒間期細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MACS和FACS分離富集胎兒細(xì)胞的效率分別為44%和13%，與羊水或絨毛核型分析相比對(duì)胎兒染色體非整倍體異常檢測(cè)的敏感性為60%。表明胎兒細(xì)胞可用來診斷胎兒非整倍體，但尚不能滿足臨床應(yīng)用的要求。

    影響胎兒細(xì)胞應(yīng)用于臨床診斷的因素首先是富集效率低，能獲得的胎兒細(xì)胞數(shù)量太少。也有研究發(fā)現(xiàn)孕婦外周血中NRBC不只是來自胎兒，也含有母源細(xì)胞。Troeger等利用Y染色體特異標(biāo)志物和RhD基因?qū)Ω患降挠泻思t細(xì)胞進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)孕婦外周血中NRBC僅大約50%為胎兒源性。因此，在利用NRBC進(jìn)行非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷時(shí)，須對(duì)分離到的NRBC來源進(jìn)行鑒定，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    在對(duì)分離到的胎兒NRBC進(jìn)行染色體分析時(shí)，F(xiàn)ISH是最常用的方法。巴塞爾實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)鑒定后的NRBC，采用FISH方法時(shí)，大多數(shù)細(xì)胞難以進(jìn)行熒光標(biāo)記。這可能是由于母體循環(huán)中的胎兒細(xì)胞具有凋亡特征，細(xì)胞核的密度增高以及這些胎兒細(xì)胞從相對(duì)低氧的胎兒環(huán)境進(jìn)入到富氧的母體循環(huán)，細(xì)胞受到影響的原因。而且在FISH結(jié)果分析中，研究者必須目測(cè)篩選成百上千個(gè)分裂間期核，勞動(dòng)強(qiáng)度高，并帶有主觀性。這些因素都影響了孕婦外周血中胎兒NRBC在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用。

    盡管如此，圍繞著利用胎兒細(xì)胞進(jìn)行無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷的工作仍然在不斷地探索中。策略之一是尋找新的胎兒NRBC特異性標(biāo)志物。另外，改進(jìn)或選擇新的胎兒NRBC的富集方法和分選技術(shù)也是研究的方向。如使用合適的重量克分子滲透壓濃度結(jié)合二倍密度梯度離心法可大幅度提高胎兒NRBC富集效率。Huang等使用微流體磁化方法分離NRBC，可將分離率提高10～20倍，采用散射光譜技術(shù)能夠提高鑒別胎兒NRBC的能力?；贔ISH掃描的自動(dòng)化顯微操縱技術(shù)用于檢測(cè)早、中期妊娠母血標(biāo)本也顯示出良好的應(yīng)用前景。類似于干細(xì)胞的胎兒細(xì)胞被認(rèn)為可能適宜進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，如果孕婦外周血中胎兒細(xì)胞能夠培養(yǎng)成功，可以獲得足夠的用于核型分析的胎兒細(xì)胞，再結(jié)合改進(jìn)的FISH技術(shù)，如光譜核型分析（spectral karyotyping，SKY），可能使得非侵入性產(chǎn)前診斷胎兒非整倍體出現(xiàn)突破性進(jìn)展。

    二、利用孕婦血漿中細(xì)胞游離胎兒DNA檢測(cè)胎兒非整倍體

    自1997年Lo等在孕婦血漿和血清中檢出游離胎兒DNA以后，關(guān)于游離胎兒DNA的臨床應(yīng)用研究受到許多關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)懷有染色體非整倍體胎兒的孕婦，其血漿或血清中胎兒游離DNA濃度高于懷有正常胎兒的孕婦，但是在部分正常和非正常妊娠之間胎兒游離DNA濃度存在重疊。另外，在孕11～17周，胎兒DNA平均含量僅占孕婦血漿中細(xì)胞游離總DNA含量的大約3%。母源性游離DNA占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，這就意味著使用傳統(tǒng)的DNA提取技術(shù)和熒光定量PCR方法難以對(duì)胎兒染色體非整倍體異常進(jìn)行準(zhǔn)確診斷。

    解決這一問題的途徑之一是可以通過改進(jìn)提取方法，增加提取的胎兒DNA的濃度或抑制母體DNA濃度，減少背景DNA。有研究表明，母血循環(huán)中胎兒DNA分子一般比母體DNA分子要短，絕大部分小于313 bp。Deng等報(bào)道，擴(kuò)增片段長度在180 bp以下的Y特異的短串聯(lián)重復(fù)序列，可以提高胎兒等位基因的檢出率。Jorgez等利用凝膠電泳方法選擇性回收母血中不同大小片段DNA，結(jié)合全基因組掃描分析，發(fā)現(xiàn)回收100～300 bp范圍的片段，可以獲得更多的細(xì)胞游離胎兒DNA。Dhallan等認(rèn)為在抗凝的外周血中加入少量10%甲醛可減少母體血液中白細(xì)胞裂解，從而增加游離胎兒DNA在母體DNA中比例。但是一些研究結(jié)果不支持這一觀點(diǎn)。

    克服上述不足的另一個(gè)途徑是尋找孕婦外周血中新的胎兒特異性標(biāo)志物，使之能夠像檢測(cè)Y特異序列或RhD血型一樣，不受高濃度母體背景DNA的影響。近年來表觀遺傳學(xué)的研究為這一設(shè)想提供了可能。表觀遺傳是指DNA序列不發(fā)生變化但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)也是最重要的基因表觀修飾方式之一。DNA甲基化是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下使CpG二核苷酸 5′端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?5′甲基胞嘧啶。這種 DNA修飾方式并沒有改變基因序列，但是它調(diào)控了基因的表達(dá)。一般情況下，DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。

    2002年P(guān)oon等利用甲基化特異性 PCR方法，不僅從母血漿中檢測(cè)到胎兒從父系繼承下來的甲基化等位基因，還檢測(cè)到從母系繼承來的胎兒非甲基化等位基因，說明胎兒與母體之間的基因位點(diǎn)上存在不同的甲基化形式。這一結(jié)果為無創(chuàng)傷性診斷胎兒非整倍體提供了依據(jù)。Chim等研究顯示，編碼maspin 基因的SERPINB5基因，在胎盤細(xì)胞中處于低甲基化，而在母血細(xì)胞中處于高甲基化。因?yàn)樘ケP是血漿中游離胎兒DNA的主要來源，而母血細(xì)胞是血漿中母體DNA的主要來源，推測(cè)利用胎兒和母血細(xì)胞之間存在的DNA甲基化狀態(tài)的差異，可以進(jìn)行胎兒非整倍體的檢測(cè)。而maspin 基因位于18號(hào)染色體，因此可以通過檢測(cè)maspin 基因的甲基化情況，診斷胎兒18-三體。

    在此研究思路下，Tong等應(yīng)用表觀遺傳學(xué)等位基因比率（epigenetic allelic ration，EAR）分析方法，利用maspin 基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的一個(gè)雜合性SNP位點(diǎn)（A/C），進(jìn)行等位基因定量分析。發(fā)現(xiàn)妊娠有該雜合SNP 位點(diǎn)正常二倍體胎兒的孕婦，外周血中兩種低甲基化的maspin等位基因的比率為1∶1，而妊娠18-三體綜合征胎兒的孕婦，外周血中兩種低甲基化的maspin等位基因的比率為1∶2或2∶1，從而證明聯(lián)合利用此差異性甲基化位點(diǎn)和位于此位點(diǎn)的SNP位點(diǎn)，可以進(jìn)行胎兒18-三體的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。但是，這種方法也有明顯的不足，一個(gè)限制就是母親必須是C/C純合子，胎盤的基因型必須是A/C雜合子，但這種變異很少見，或許還存在種族差異，比如在129例高加索人的胎盤中未發(fā)現(xiàn)C等位基因。另外也有一個(gè)技術(shù)問題就是甲基化特異性 PCR過程中使用的重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換步驟，能夠?qū)е卤緛砭秃苌俚奶篋NA模板被大量破壞，這將嚴(yán)重妨礙試驗(yàn)的效果。因此，有必要探索更恰當(dāng)?shù)脑囼?yàn)方法或策略。

    唐氏綜合征由于其發(fā)病率高而備受關(guān)注，為了尋找21號(hào)染色體的表觀遺傳標(biāo)記，Hultén等采取了3種策略進(jìn)行篩選，結(jié)果在21q22.3發(fā)現(xiàn)了3個(gè)差異甲基化序列。其中AIRE基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG位點(diǎn)高度差異甲基化，可作為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷唐氏綜合征重要的候選表觀遺傳標(biāo)記。Chim等采用甲基化敏感的單核甘酸引物延伸和（或）重亞硫酸鹽測(cè)序的方法，系統(tǒng)性搜尋21號(hào)染色體上的甲基化位點(diǎn)，在114個(gè)CpG島中，有22個(gè)顯示出母體和胎兒間的表觀遺傳學(xué)差異。隨著這些表觀遺傳標(biāo)記研究的不斷深入，有可能使無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷胎兒染色體非整倍體成為現(xiàn)實(shí)。

    三、利用孕婦血漿中細(xì)胞游離胎兒mRNA檢測(cè)胎兒非整倍體

    2000年 Poon等在孕有男胎的孕婦血漿中首次檢測(cè)到 Y染色體特異性鋅脂蛋白（**Y）mRNA。此后許多研究證實(shí)了孕婦外周血中存在著游離胎兒RNA。這些游離胎兒RNA主要來自胎盤，在孕婦血漿中含量豐富，具有極好的穩(wěn)定性，并且與血漿中胎兒DNA一樣，于產(chǎn)后迅速從血漿中清除。這些特性顯示了利用孕婦外周血中游離RNA檢測(cè)胎兒異常是可行的。Lo等報(bào)道了測(cè)定胎盤特異性因子4（placental-specific 4，PLAC4）基因表達(dá)產(chǎn)物診斷胎兒非整倍體的研究結(jié)果。PLAC4基因來自胎盤，僅在胎盤表達(dá)，具有胎兒特異性。該基因定位于21號(hào)染色體，因此，Lo等推測(cè)定量分析孕婦血漿中PLAC4 mRNA可以用于診斷胎兒21-三體綜合征。

    由于普通的熒光定量難以滿足檢測(cè)要求，Lo等利用堿基延伸反應(yīng)和基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）檢測(cè)PLAC4 mRNA。他們選擇了PLAC4基因內(nèi)的SNP雜合位點(diǎn)進(jìn)行等位基因比率定量分析。在正常二倍體，PLAC4 mRNA轉(zhuǎn)錄的每一個(gè)等位基因量是相等的，其比率應(yīng)為1∶1；而在非整倍體，如21-三體，其比率將是2∶1或1∶2。Lo等檢測(cè)了10例21-三體的胎兒，結(jié)果顯示診斷的敏感性為90%，特異性為96%。在57例對(duì)照中正確判斷了55例正常二倍體，該研究雖然例數(shù)不多，但是很有意義，表明了一種無創(chuàng)傷性診斷胎兒非整倍體的新的策略方法。該方法的不足之處在于受檢胎兒的SNP位點(diǎn)必須是雜合子，這種基因型只出現(xiàn)于大約50%的被檢者，因此必須發(fā)現(xiàn)更多的SNP位點(diǎn)，或者增加21號(hào)染色體特異的細(xì)胞游離胎兒RNA的種類。胎兒基因表達(dá)譜的研究將有助于這項(xiàng)工作的進(jìn)一步開展。Tsui等用同樣的RNA-SNP等位基因比率分析方法檢測(cè)母血漿中胎盤特異的SERPINB2基因轉(zhuǎn)錄的 mRNA，檢測(cè)出18三體異常。

    由于MALDI-TOF MS檢測(cè)方法的局限性，Lo等將數(shù)字PCR用于RNA-SNP的檢測(cè)，該方法可以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)出微量的模板拷貝數(shù)變化，這項(xiàng)技術(shù)優(yōu)于質(zhì)譜之處在于胎兒不必是SNP位點(diǎn)的雜合子，對(duì)純合子胎兒也可以檢測(cè)，不僅簡(jiǎn)化了操作，而且擴(kuò)大了應(yīng)用范圍，提高了檢測(cè)的有效性和準(zhǔn)確性。Go等[39]將淬滅延伸反應(yīng)和部分變性高效液相色譜應(yīng)用于RNA SNP方法 成功檢測(cè)出21-三體胎兒，使得RNA SNP方法不必依賴于昂貴的MALDI-TOF MS設(shè)備。

    選擇細(xì)胞游離胎兒RNA進(jìn)行無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷的主要優(yōu)勢(shì)在于基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的多拷貝性。另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是胎盤表達(dá)的特異的mRNA種類是母體任何組織都不表達(dá)的，易于檢測(cè)，與前述的利用表觀遺傳學(xué)差異選擇胎兒特異的標(biāo)記物一樣，分析胎盤來源的RNA類似利用胎兒DNA檢測(cè)Y特異序列或RhD血型，母體血漿中完全缺乏這種物質(zhì)，因此檢測(cè)不受強(qiáng)大的母體DNA背景的干擾。

    四、結(jié)語

    每年有成百萬孕婦需要接受胎兒染色體異常的產(chǎn)前篩查，高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦要面對(duì)侵入性診斷所帶來的壓力，而無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷為她們提供了一種理想的、對(duì)胎兒無風(fēng)險(xiǎn)的診斷途徑。雖然利用孕婦血漿中胎兒DNA檢測(cè)Y染色體特異序列以及RhD血型已經(jīng)常規(guī)應(yīng)用于臨床。但是對(duì)胎兒非整倍體異常的無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷仍然存在著檢測(cè)效率低、實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜、研究的樣本量小等不足，因此目前尚不能滿足臨床應(yīng)用的要求。然而，隨著孕婦外周血中胎兒物質(zhì)富集技術(shù)的提高、新的檢測(cè)方法的應(yīng)用、多中心研究的開展以及診斷策略的完善，這項(xiàng)技術(shù)將最終能夠成為具有臨床價(jià)值的檢測(cè)方法。（無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷胎兒染色體非整倍體的研究進(jìn)展 劉福民）