胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率在世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤中占第二位，其發(fā)病機制目前并不十分清楚。大多數(shù)學(xué)者認為，胃癌的發(fā)生是物理、化學(xué)、生物等多因素、多階段的發(fā)展過程。1990年Burke等首次報道了1例EBV陽性胃癌，自此EBV感染與胃癌的關(guān)系受到關(guān)注。EBV最初是由Epstein和Barr從非洲伯基特淋巴瘤（BL）培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的，它與多種人類腫瘤有關(guān)。目前，對EBV相關(guān)胃癌的研究主要在臨床病理方面，而EBV感染后胃上皮細胞變化的分子機制尚不明確。筆者采用EBV感染和PAR-2基因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的胃上皮細胞系GES-1,對比分析細胞生物學(xué)特性的變化，從而探討PAR-2基因在EBV致胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

    1.材料與方法

    1.1主要試劑

    脂質(zhì)體Lipofect AMINETM 2000 regent,G418購自Invitrogen公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶、XDNA/Hind m maker，200 by DNA stepladder、瓊脂糖購自華美生物技術(shù)工程公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清（FCS）購自基因公司；免疫細胞化學(xué)染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；胃癌病人血清為來自本院腫瘤科；載體和細胞株：pcDNA3空載體質(zhì)粒、pcDNA3-c-myC重組質(zhì)粒及攜帶NEW基因的重組EBV產(chǎn)生細胞系A(chǔ)kata 1061均為廣州安必平生物科技有限公司提供；人胃上皮細胞系GFS-1由南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供；大腸桿菌HB 101由安必平生物科技有限公司提供。

    1.2 細胞的培養(yǎng)

    人胃上皮細胞系GES-1用含10%FCS,100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞2~3天換1次液，細胞融合約達80%時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。Akata細胞為懸浮生長的淋巴細胞，具有G418抗性。常規(guī)懸浮細胞培養(yǎng)方法，另含700mg/L G418。

    1.3 pcDNA3-PAR-2重組質(zhì)粒及pcDNA3空載體質(zhì)粒的獲得

    取感受態(tài)的大腸桿菌，按質(zhì)粒小量提取方法進行質(zhì)粒DNA的提取和純化，用BamHI酶切后電泳鑒定，用Quantity one圖像分析軟件進行灰度測定，計算提取質(zhì)粒的濃度，并根據(jù)此濃度確定轉(zhuǎn)染所需的量。

    1.4 基因轉(zhuǎn)染及陽性克隆篩選

    將pcDNA3-c-myc重組質(zhì)粒及pcDNA3空載體質(zhì)粒按1：2~1：3的量用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染24孔板中90%~93%融合的GES-1細胞，按試劑盒操作手冊進行。37℃轉(zhuǎn)染5h后，加人FCS至終濃度10%。48h后用有限稀釋法進行陽性克隆，并置于含300mg/L G418（根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果而定）的選擇培養(yǎng)基中，篩選培養(yǎng)2周，待抗性單克隆長至足夠大，挑取單克隆集落，擴大培養(yǎng)，制備細胞片。EBV感染及陽性克隆篩選：感染前3天，Akata1061細胞稀釋至2×103/ml，加入終濃度為0.5%山羊抗人降解血清，于37℃培養(yǎng)2h，不時輕輕搖動，然后以PBS洗2次，以含10 % FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。感染前1天，將GES-1細胞以2mmol/LEIYI'A/PBS消化下來，置于12孔培養(yǎng)板中，每孔2ml培養(yǎng)基，含5×103細胞。轉(zhuǎn)染當(dāng)天更換等體積培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染時每孔加人1ml Akata細胞懸液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)3天。在第2天更新一半培養(yǎng)基，使FCS濃度降至5%。此過程結(jié)束后，以PBS洗4次，加人2 ml含10% FCS的培養(yǎng)基。感染后第5天，將細胞消化下來，稀釋至2×102/ml，接種于96孔板中培養(yǎng)至克隆形成。此過程中，培養(yǎng)基中加入終濃度為300mmol/L的G418和終濃度為1mmol/L的更昔洛韋（僅第1周）。將所獲得的細胞克隆常規(guī)培養(yǎng)并制備細胞片。

    1.5 EBNAl及PAR-2蛋白的檢測

    將EBV感染細胞片用FTIC標(biāo)記的免疫細胞化學(xué)方法檢測EBNAI的表達；感染和轉(zhuǎn)染細胞片檢測PAR-2蛋白的表達。免疫細胞化學(xué)檢測方法按說明書操作，以PBS代替一抗作為陰性對照，以細胞內(nèi)出現(xiàn)明確亮綠色判定為陽性結(jié)果。

    1.6 細胞生長曲線測定

    取EBV感染、c-myc基因轉(zhuǎn)染及對照細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用0.25%胰酶消化制成單細胞懸液，經(jīng)計數(shù)后以3×103個/孔接種于24孔板，每孔加人無血清培養(yǎng)基2ml培養(yǎng)1天使細胞同步化，換入含10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基2ml繼續(xù)培養(yǎng)。每天取4孔進行細胞計數(shù)，每孔重復(fù)計數(shù)3次，取其平均值，連續(xù)計數(shù)7天，以時間為橫坐標(biāo)，細胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制細胞生長曲線。

    1.7 軟瓊脂克隆形成試驗

    在6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔先加入0.66%底層瓊脂3ml（1.5ml 1.3%瓊脂冷卻至55℃左右，與1.5ml預(yù)溫的37℃含2×RPMI1640培養(yǎng)基混勻），待凝固后，加入0.33%的含細胞的上層瓊脂3ml，每組細胞均做復(fù)孔。置濕盒，在37℃，5% CO2及飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)2~3周，觀察軟瓊脂中細胞集落的形成。

    1.8 細胞周期的測定

    分別收集各組細胞，經(jīng)0.25%胰酶消化，離心收集細胞，冷PBS洗滌2次。加入預(yù)冷的70%酒精，4℃固定過夜。800~1000×g離心棄上清，冷PBS離心洗滌2次并重懸，制成單細胞懸液，注意離心速度不宜過快。等體積細胞懸液和碘化丙啶（ PI）染液混合，4℃放置20min×300目尼龍過濾，加樣入流式細胞分析儀樣品室，進行細胞周期檢測。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。設(shè)定P<0.05為差異有顯著性。

    2.結(jié)果

    2.1 PWNA3-PAR-2重組質(zhì)粒的鑒定

    擴增純化的pcDNA3- PAR-2重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ酶切、電泳，可見PAR-2基因大小為1.3kb，pcDNA3載體為5.4kb，恰好在pcDNA3的BamHⅠ位點，與所提供的質(zhì)粒圖譜相符（圖1）和PAR-2蛋白表達，轉(zhuǎn)染了PAR-2基因的GES-1細胞有PAR-2蛋白表達，細胞均被染成亮綠色，陽性結(jié)果主要出現(xiàn)在細胞核，部分在細胞質(zhì)，而空載體轉(zhuǎn)染組及正常GES-1細胞均為陰性（圖2、圖3）。

    2.2 細胞形態(tài)學(xué)變化

    正常的GES-1細胞呈短梭形，大小較為一致，核較小呈圓形或橢圓形；感染及轉(zhuǎn)染組細胞體積變大，呈橢圓形或多角形，核變大，核漿比增大，折光性增強，與正常GES-1細胞相比較，細胞增殖迅速，細胞生長的接觸性抑制不明顯，出現(xiàn)“成瘤性”生長（圖4）。

    2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

    FlTC標(biāo)記免疫細胞化學(xué)染色顯示，感染了EBV的GES-1細胞有EBNA1。

    2.4 細胞生長曲線測定

    細胞生長曲線如圖3，可見EBV感染細胞及c-myc基因轉(zhuǎn)染細胞數(shù)量均顯著高于空載體轉(zhuǎn)染細胞，并隨培養(yǎng)時間增加，這一差異越來越明顯；空載體轉(zhuǎn)染細胞數(shù)與正常GES-1細胞相比差異無顯著性（圖3）。

    2.5 細胞周期測定

    經(jīng)流式細胞儀進行細胞周期分析發(fā)現(xiàn)，EBV感染和c-myc基因轉(zhuǎn)染細胞S期細胞比例[（70.%±0. 91%）和（67%±3 .06%）]顯著高于pcDNA3轉(zhuǎn)染對照細胞（34.74%±1.03%），差異有顯著性（P<0.05）。而EBV感染與PAR-2基因轉(zhuǎn)染細胞之間，以及pcDNA3轉(zhuǎn)染細胞與正常GES-1細胞（49.35 %±1.16%）之間差異無顯著性。

    3.討論

    EBV是人類皰疹病毒N型，屬DNA腫瘤病毒，EBV在人群中廣泛存在，多數(shù)人幼兒期就感染EBV,且終生攜帶。EBV與BL、鼻咽癌（NPC）的關(guān)系最為明確，近年來EBV在上皮源性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用備受關(guān)注。1990年等Burke首次報道了1例EBV陽性胃癌以來，EBV感染與胃癌的關(guān)系受到關(guān)注。c-myc原癌基因在多種人類腫瘤細胞中均有擴增和高表達。有研究表明，在EBV相關(guān)的多種腫瘤如BL、NPC中都存在。my基因高表達，而PAR-2基因過度表達可以改變細胞內(nèi)基因調(diào)控，引起其他癌基因的活化或抑癌基因的失活，使細胞易于轉(zhuǎn)化為惡性表型，從而啟動或加速腫瘤發(fā)生。在對人鼻咽上皮細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，c- my基因表達增高能激活端粒酶活性，從而誘發(fā)腫瘤。有報道EBV陽性胃癌表達EBNA 1、BARFO、BARE 1和EBERs，將BARE 1基因?qū)敕侵铝鲂詌ouckes淋巴細胞中可活化PAR-2原癌基因。

    另外，臨床病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)患有PAR-2產(chǎn)物陽性浸潤性胃癌的病人預(yù)后明顯差于PAR-2產(chǎn)物陰性腫瘤的病人。因此推測PAR-2基因在EBV相關(guān)胃癌的形成過程中起到一定的作用。實驗中用的GES-1細胞為SV40感染原代培養(yǎng)的胎兒正常胃黏膜上皮細胞建立的細胞系，染色體為近三倍體（50~60之間）。除了轉(zhuǎn)化特性之外，GES-1細胞基本保留了正常的細胞骨架結(jié)構(gòu)，角蛋白反應(yīng)陽性，接種在裸鼠中6個月觀察無致瘤性，此細胞系為研究胃上皮細胞癌變提供重要的模式系統(tǒng)。Akata細胞來源于EBV陽性BL病人，通過同源重組插入一個新霉素抗性基因（Neo），因此具有G418抗性。經(jīng)抗免疫球蛋白處理后，能產(chǎn)生大量重組EBV（每個細胞含EBV質(zhì)粒20個拷貝）。Akata細胞適合重組EBV克隆繁殖，是探測EBV遺傳學(xué)的有效工具，使EBV作為基因治療的載體成為可能。

    本實驗中，感染上皮細胞前，Akata細胞以0.5%山羊抗人降解血清預(yù)處理，目的即是產(chǎn)生大量重組EBV。由于Akata細胞中含另一個藥物敏感基因（大T基因），因此培養(yǎng)基中加人1pmol的更昔洛韋后，Akata細胞被除去。用Imai等創(chuàng)立的密切接觸法使人胃上皮細胞系GES-1感染重組EBV，用堿裂解法獲得質(zhì)粒，經(jīng)過酶切鑒定后采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將PAR-2基因轉(zhuǎn)入GES-1細胞，以pcDNA3空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染同一細胞為對照，由于pcDNA3攜帶GADPH基因，因此也具有G418抗性。經(jīng)過G418篩選得到EBV感染和PAR-2基因轉(zhuǎn)染的陽性克隆。對感染和轉(zhuǎn)染細胞進行鑒定，用熒光（ME）和辣根過氧化物酶（HIiP）兩種標(biāo)記方法，細胞均被染成亮綠色或棕褐色，說明感染和轉(zhuǎn)染獲得成功，細胞均為陽性克隆。

    本實驗中，用細胞計數(shù)和Mil兩種方法測定細胞生長曲線，結(jié)果均顯示從第3天開始EBV感染組與c-myc基因轉(zhuǎn)染組細胞生長速度與對照組相比明顯加快，并且隨著培養(yǎng)時間的延長，這一差距越來越明顯，到第7天EBV感染組細胞達到3.85×105個，幾乎為對照組細胞數(shù)量的2倍，PAR-2基因轉(zhuǎn)染組細胞數(shù)為3.14×105個，與感染組相比差異無顯著性。細胞周期測定顯示感染與轉(zhuǎn)染組細胞S期細胞數(shù)目增多，兩組之間差異無顯著性，說明處于增殖期的細胞較多，此結(jié)果與細胞生長曲線結(jié)果相一致。經(jīng)過熒光染色發(fā)現(xiàn)EBV感染細胞中有c-myc基因表達，提示EBV感染上皮細胞后可能通過某種方式上調(diào)PAR-2基因，引起其他癌基因變化，進一步影響細胞周期，使細胞增殖加快，從而使細胞發(fā)生永生化。實驗中EBV感染的GES-1細胞發(fā)生明顯形態(tài)學(xué)改變，由原來的短梭形變得更為飽滿，細胞及細胞核體積明顯增大，核漿比增大，細胞增殖迅速，細胞生長的接觸性抑制不明顯，說明EBV感染的細胞已經(jīng)具有腫瘤細胞的某些特性。正常細胞生長依賴錨泊，有密度依賴抑制或接觸抑制，腫瘤細胞則缺乏這種生長限制，甚至可在半固體瓊脂中成懸浮生長，不需要依附固定表面，不受密度限制，可持續(xù)分裂堆積生長。軟瓊脂集落形成試驗是測定細胞成瘤性的一種有效方法。單細胞在體外持續(xù)增殖6代以上所組成的細胞群體，稱為集落或克隆，可含有50個以上的細胞，大小在0.3~1.0mm之間。通過計數(shù)集落形成率，可對細胞的增殖潛力做定量分析。

    本實驗中軟瓊脂中未見有細胞集落形成，提示EBV感染雖然可使胃上皮細胞增殖加快，但尚未轉(zhuǎn)化為腫瘤細胞，即胃上皮細胞尚未發(fā)生癌變。究其原因，可能是因為實驗中EBV感染上皮細胞的時間相對較短，而EBV相關(guān)胃癌的發(fā)生可能與EBV的長期潛伏有關(guān)。另外，腫瘤發(fā)生過程中癌基因與抑癌基因的相互作用也是一個漫長的發(fā)展過程。這種增殖加快的上皮細胞是否屬于癌前病變的細胞，有待進一步研究。

    綜上所述，EBV相關(guān)胃癌的發(fā)生及發(fā)展過程是十分復(fù)雜的。EBV感染胃上皮細胞后，表達諸如BARF1之類的病毒基因，通過這些基因產(chǎn)物激活c-myc、PAR-2基因等癌基因及一系列抑癌基因，進而影響細胞周期，細胞增殖加快，再在某些因素的影響下轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細胞。因此，PAR-2基因基因可能是EBV陽性胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵介導(dǎo)基因。（Chinese Journal of Current Clinical Medicine劉換新，陳娟，劉梅，葉春）